Gertrude Stein nació en Allegheny, Pennsylvania, el 3 de febrero de 1874, fue la menor de los cinco hijos de Daniel y Amelia Stein, un acomodado matrimonio de origen judío-alemán-americanos. De niña vivió en Viena, Austria, y París, Francia, pero se crió principalmente en Oakland, y San Francisco, California. Al vivir en estos diferentes países, aprendió a hablar alemán, francés e inglés con fluidez. También aprendió música y danza. Su primera educación formal fue irregular, pero era una lectora dedicada y tenía un gran interés en el arte. Cuando tenía catorce años su madre murió, y sólo tres años más tarde murió su padre. Con la familia desintegrada,
Stein, junto con una hermana, se trasladaron a Baltimore, Maryland, a vivir con su tía.
Con tan sólo un año de la escuela secundaria, Stein logró ser admitida en 1893 en la Universidad de Radcliffe, en Massachusetts, donde se especializó en psicología y se convirtió en favorita del psicólogo y filósofo William James (1842-1910). Él descubrió su gran capacidad para la escritura automática, en la que se suspende la mente de vigilia consciente y la mente inconsciente del sueño se hace cargo. El énfasis de la mente primitiva, a expensas de la mente sofisticada iba a convertirse en una parte importante en la teoría de Stein y se demuestra en la mayor parte de sus escritos.
Stein no obtuvo un grado en Radcliffe ni en la Universidad Johns Hopkins, en Maryland, donde estudió medicina durante cuatro años. En 1903 se fue a París, Francia, con su hermano Leo. En 1907 conoció a Alice B. Toklas (1877-1967), una acaudalada joven de San Francisco que se convirtió en su compañera de toda la vida y también en su secretaria, ocupándose del manejo hogar, de tipear sus manuscritos, y de controlar de los visitantes. Francia se convirtió en su hogar permanente.
Durante sus primeros años en París se estableció como una defensora de los pintores de vanguardia, apoyánmdolos económicamente con su riqueza heredada. Conocía prácticamente a todos los pintores importantes, entre ellos Pablo Picasso, que hizo un famoso retrato de ella;
Henri Matisse,
Juan Gris, Andrée Derain y
Georges Braque. Su hermano Leo se convirtió en un famoso crítico de arte, pero su relación, que había sido muy estrecha, se vino abajo en 1912 a causa de un desacuerdo sobre su matrimonio.
Los primeros dos libros de
Stein,
Tres Vidas (1909) y
Tender Buttons (1915), provocaron un gran interés entre un público limitado pero sofisticado, y su casa se convirtió en un lugar de encuentro informal visitado por muchas personas creativas, incluyendo el compositor estadounidense
Virgil Thomson, los escritores británicos
Ford Madox Ford, Lytton Strachey y Edith Sitwell, y los escritores estadounidenses
Ezra Pound, Elliot Paul, Sherwood Anderson, F. Scott Fitzgerald, y
Ernest Hemingway. Fue en Hemingway en quien
Stein caracterizó a los desencantados veteranos expatriados como una "generación perdida".
En 1934 Stein visitó los Estados Unidos para la apertura de su ópera Cuatro santos en tres actos, con música de Virgil Thomson, comenzó con enorme éxito una gira de conferencias de la universidad. Durante la ocupación alemana de Francia, vivió brevemente en Culoz, Francia, regresando a París en 1944. Las reacciones de Stein a la Segunda Guerra Mundial se registraron en París, Francia (1940) y Las guerras que he visto (1945), y su interés en los soldados se reflejó en las Conversaciones de Brewsie y Willie (1946), publicada una semana antes de su muerte, el 27 de julio de 1946, en Neuilly, Francia.